【神经遗传】中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤患者临床病理学特征及髓样分化因子88 L265P基因突变分析

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文章来源：中华神经科杂志, 2022,55(7) : 682-689

作者：王丹丹 王苗 王雷明 高敏 程磊 谢丽梦 魏宇魁 邹东梅 赵莉红 王伟民 熊艳蕾 滕梁红

摘要

目的

探讨中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者的临床病理学特征及其髓样分化因子88（MYD88）L265P基因突变情况。

方法

收集首都医科大学宣武医院于2014年9月至2017年2月诊断的45例中枢神经系统DLBCL患者的病理学标本，分析其临床病理资料，并结合免疫组织化学染色结果、EB病毒原位杂交结果、影像及病史进行回顾性分析，检测MYD88 L265P突变并分析其临床意义。

结果

45例患者中男性24例，女性21例，年龄42~82（57.6±8.8）岁。93.3%（42/45）的患者肿瘤累及幕上，呈单发或多发，大脑半球（31/45，68.9%）是最常见的受累部位，21例（21/45，46.7%）病变为多发性病灶。组织学上，中枢神经系统DLBCL表现为肿瘤组织弥漫浸润，部分围绕血管生长，呈“袖套状”排列。免疫表型：所有标本CD₂₀、CD₇₉a均弥漫强阳性，其中39例（39/45，86.7%）为非生发中心B细胞（非GCB）型，6例（6/45，13.3%）为生发中心B细胞（GCB）型。64.4%（29/45）的病例存在MYD88 L265P突变。MYD88 L265P突变的病例在非GCB型（71.8%，28/39）与GCB型（1/6）中所占比例差异有统计学意义（P=0.017）。治疗方式是预后的独立相关因素，与手术/活组织检查（活检）未化学治疗组相比，手术+化学治疗（HR=0.05，95%CI 0.01~0.33，P=0.002）、活检+化学治疗（HR=0.04，95%CI 0.01~0.36，P=0.004）、手术/活检+化学治疗+干细胞移植（HR=0.01，95%CI 0.00~0.17，P=0.001）均能改善生存预后。

结论

中枢神经系统DLBCL临床表现复杂多样，诊断具有挑战性，预后差。MYD88 L265P是中枢神经系统淋巴瘤常见的基因突变，在非GCB型中的检出率高于GCB型。原发性中枢神经系统淋巴瘤患者化学治疗可明显提高患者生存率，化学治疗达到完全缓解后，行自体造血干细胞移植治疗，可能有机会获得长期生存。

中枢神经系统淋巴瘤包括原发性中枢神经系统淋巴瘤（primary central nervous system lymphoma，PCNSL）和继发性中枢神经系统淋巴瘤（secondary central nervous system lymphoma），临床表现为侵袭性行为，预后差。PCNSL 是一种少见的结外非霍奇金淋巴瘤，起源于脑、脊髓、软脑膜、脑神经及眼内的淋巴瘤，并局限于中枢神经系统，并无其他系统组织或器官受累。中枢神经系统淋巴瘤最常见的病理亚型为弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL），可占80%~90%^{［1, 2, 3, 4］}。采用基因表达谱分析可将DLBCL分为 3 种类型：生发中心B细胞（germinal center B-cell-like，GCB）型、活化B细胞（active B-cell like type，ABC）型及第3型^［5］。髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MYD88）是Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）和白细胞介素-1（IL1）受体信号通路中的衔接分子，通过激活核因子-κB信号通路参与肿瘤的发生^［6］。MYD88基因突变发生于多种B细胞淋巴瘤中，有研究发现ABC型DLBCL中亦存在MYD88基因突变^［7］。我们收集了中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的标本，分析其临床病理学特点及预后，同时检测MYD88 L265P基因突变情况，进一步了解该疾病的临床病理特征，为临床诊断及治疗提供支持及依据。

资料和方法

一、标本收集及临床资料

收集首都医科大学宣武医院于2014年9月至2017年2月诊断的45例中枢神经系统DLBCL患者的病理学标本，均为在患者知情同意情况下，行头颅CT、MRI检查定位及行开颅手术切除或活组织检查（活检）的肿瘤组织。术后间隔5 mm逐一切开组织，取材，常规包埋和连续切片，分别进行HE染色及免疫组织化学染色。由2名淋巴造血系统专业组病理医师复习其HE染色及免疫组织化学切片，依据2016版世界卫生组织修订版《中枢神经系统肿瘤》分类标准^［4］复阅切片，重新确诊。通过电子病历及电话随访收集患者的临床资料，并总结其治疗及随访情况。

本研究为横断面研究。

二、免疫组织化学染色

对原标本采用EnVision二步法进行免疫组织化学染色，抗体包括：抗神经元核抗原（neuron specific nuclear protein，NeuN）抗体、抗胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗体以及抗CD₃、CD₂₀、CD₇₉a、Pax5、CD₁₀、Bcl-6、Bcl-2、MUM-1、CD₂₁、Ki67及C-myc抗体。阴性对照：以磷酸盐缓冲液代替一抗进行免疫组织化学染色，作为阴性对照；阳性对照：抗NeuN、GFAP抗体以脑组织作为阳性对照，其余抗体以淋巴结作为阳性对照。抗体均为工作液，EnVision试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。采用Leica全自动染色仪（徕卡仪器有限公司，德国），按照说明书操作进行免疫组织化学染色检测。观察所有标本的病理学特征。根据Hans模型，应用抗CD₁₀、Bcl-6及MUM-1免疫组织化学抗体组合将DLBCL分为GCB和非GCB 2种类型。

三、EB病毒（Epstein-Barr virus）原位杂交

对肿瘤标本进行EB病毒原位杂交检测，探针及试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，按照说明书进行操作；选用EB病毒阳性的自然杀伤/T细胞淋巴瘤作为阳性对照，磷酸盐缓冲液代替一抗为阴性对照。判断标准：胞核呈棕黄色为阳性。

四、DNA提取及质量检测

使用天根石蜡包埋组织DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取标本中的DNA。A₂₆₀/A₂₈₀在1.7~1.9为质量合格。

五、焦磷酸测序

对标本行焦磷酸测序，通过使用一对特定的引物（其中一个是生物素化的）来扩增包含突变位点的短序列DNA（在本例中是反向引物）。然后，利用链霉亲和素包被的海藻糖微珠将生物素标志特异性地结合到反向引物上，制备单链扩增突变区。随后用正向测序引物孵育后，在Qiagen PyroMark Q24焦磷酸测序仪（凯杰公司，美国）平台上进行测序。等位基因频率使用Qiagen软件进行量化。引物的设计与合成（北京奥科生物技术有限责任公司）如下：MYD88-265-正向：5′-GTGTGTCTG-ACCGCGATGT-3′；MYD88-265-反向：5′-bio- GCTGGGGAACTCTTTCTTCATTG-3′；MYD88-265- sequence-正向：5′-TGCCCATCAGAAGCG-3′。

六、变量分层

如上文所述将病例根据性别分为男性组和女性组，根据年龄分为≥60岁组和<60岁组，按Hans分型分为GCB型和非GCB型，比较各组间的MYD88基因突变率；按治疗方式分为手术/活检未化学治疗组、手术+化学治疗组、活检+化学治疗组、手术/活检+化学治疗+干细胞移植组。比较不同性别、年龄、Hans分型、MYD88基因型、治疗方式的各组间生存差异，并进行生存预后的相关因素分析。

七、统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行整理和分析。计量资料采用均数±标准差（符合正态分布）或中位数（不符合正态分布）表示；计数资料采用频数（%）表示。计数资料的组间差异比较采用Fisher精确检验（因样本量<40例）。采用Kaplan-Meier曲线进行生存率分析，并采用Gehan-Breslow检验进行组间生存差异比较。采用单因素和多因素Cox回归模型进行PCNSL生存预后的相关因素分析。P≤0.05表示差异有统计学意义。

结果

一、临床资料

我们共收集到45例中枢神经系统淋巴瘤患者的标本，患者的年龄在42~82岁［（57.6±8.8）岁］，其中男性24例，女性21例，男性略占优势，男女比例为1.14∶1.00。患者初始临床表现为颅内压升高症状，如头痛伴或不伴呕吐28例（28/45，62.2%），头晕2例，嘴角歪斜1例，肢体无力9例（9/45，20.0%），言语错乱2例，视觉障碍1例、嗜睡2例。所有患者均行CT和MRI检查，有93.3%（42/45）的患者肿瘤累及幕上，呈单发或多发；21例（21/45，46.7%）病变为多发性病灶，53.3%（24/45）病变为单发病灶，大脑半球（31/45，68.9%）是最常见的受累部位，其次是丘脑和基底节（10/45，22.2%）。肿瘤在CT上呈等密度或高密度，T₁WI上呈等低信号，T₂WI上呈等高信号，增强后80%（36/45）的患者病灶明显强化（图1），另外有3例（6.7%）患者中等强化，5例（11.1%）患者轻度强化，1例（2.7%）患者无明显强化。

图1  1例中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤患者磁共振成像平扫+增强结果。患者男性，57岁，头痛、头晕2周，加重伴右侧肢体麻木无力1周，MRI可见脑室内团块，T₁WI（A）低信号，T₂WI（B）高信号，信号不均匀，周围可见水肿带，增强后（C）明显强化

Figure 1  Brain magnetic resonance imaging (MRI) plain scan+enhancement in a patient with diffuse large B-cell lymphoma of central nervous system. The patient was a 57-year-old male with headache and dizziness for 2 weeks, which was aggravated with numbness and weakness in the right limb for 1 week. MRI showed intraventric mass, low signal on T₁WI (A), high signal on T₂WI (B), uneven signal, surrounding edema zone, with obvious enhancement after enhancement (C)

术前影像不能明确病变性质者共22例（48.9%）；术前提示怀疑或不除外淋巴瘤者17例（37.8%），其中3例不除外转移癌；不除外转移癌或胶质瘤者1例，不除外胶质瘤3例，不除外脱髓鞘1例；45例患者中42例送术中冰冻，3例未送术中冰冻，其中34例（75.5%）术中诊断淋巴瘤或淋巴瘤可能性大，恶性肿瘤7例（其中神经上皮来源可能性大1例，不除外高级别胶质瘤2例，不除外转移癌1例）；炎性病变1例。立体定向机器人引导下脑部病变活组织检查者11例，颅内肿瘤切除术者34例。患者从发病到确诊时间从1周到半年，其中入我院前共有1例已按脱髓鞘治疗2个月，3例按脑梗死治疗。共44例被确诊为PCNSL；1例为系统性淋巴瘤累及中枢，患者2年前诊断为乳腺DLBCL。

二、病理学特征

HE染色及免疫组织化学染色下，可见肿瘤细胞弥漫浸润性生长，细胞中等到偏大，核圆形或卵圆形，略不规则，核仁明显，核分裂象多见（图2），部分围绕并侵犯血管壁，呈“袖套状”排列。45例中有39例（39/45，86.7%）为非GCB型，6例（6/45，13.3%）为GCB型^［8］。所有GCB-DLBCL均抗Bcl-2抗体染色阳性。所有病例EB病毒原位杂交结果均为阴性。

图2  中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤的病理特点。可见肿瘤细胞弥漫生长（A，HE染色），免疫组织化学染色示CD₃阴性（B）、CD₂₀弥漫阳性（C）、CD₁₀阴性（D）、Bcl-6（E）及MUM-1（F）阳性，提示非生发中心来源

Figure 2  Pathological features of diffuse large B-cell central lymphoma of central nervous system. Diffuse growth of tumor cells (A, HE staining) was shown, and immunohistochemical staining showed CD₃-negative (B), CD₂₀-positive (C), CD₁₀-negative (D), Bcl-6 (E) and MUM-1 (F) positive, suggesting non-germinal origin

三、MYD88 L265P基因突变检测结果

45例标本中共有60.0%（27/45）存在MYD88 L265P基因突变（图3）。

图3  中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤患者MYD88 L265P基因引物及测序部位基因示意图。Y代表需要检测的基因位点，如果是T，则代表没有突变，如果是C，代表有L265P突变

Figure 3  Primers and sequencing site of myoloid differentiation factor 88 L265P gene of patents with diffuse large B-cell central lymphoma of central nervous system. Y represents the locus to be tested for, T means no mutation, and C means L265P mutation

四、MYD88 L265P基因突变与临床相关性

MYD88 L265P基因的突变率在男性病例组（54.2%，13/24）与女性病例组（66.7%，14/21）之间差异没有统计学意义（P>0.05）；在≥60岁组中（52.4%，11/21）的突变率与<60岁组（66.7%，16/24）相比差异无统计学意义（P>0.05）；MYD88 L265P基因突变的病例在非GCB型DLBCL（71.8%，28/39）与GCB型DLBCL组（1/6）相比，差异有统计学意义（P=0.017）。

五、治疗及随访情况

所有患者均接受手术治疗，手术方式包括立体定向机器人引导下脑部病变活组织检查及颅内肿瘤切除术。27例患者有完整随访资料，其中1例为系统性淋巴瘤累及中枢，26例为PCNSL。26例有随访的PCNSL患者中，6例（6/26，23.1%）仅经手术治疗，未化学治疗，中位生存期<1个月；20例患者（20/26，76.9%）加用化学治疗，其中4例加用自体造血干细胞移植。化学治疗方案为大剂量的甲氨蝶呤（high-dose of methotrxate，HD-MTX）单药化学治疗或以HD-MTX为基础的联合化学治疗。这20例患者的生存中位数达到12个月，2年生存率为42.3%（11例），5年生存率为19.2%（5例）。患者的性别、年龄、Hans分型、是否存在MYD88 L265P基因突变均与患者生存率差异无统计学意义（图4）。治疗方式是预后的独立相关因素，与手术/活检未化学治疗组相比，手术+化学治疗（HR=0.05，95%CI 0.01~0.33，P=0.002）、活检+化学治疗（HR=0.04，95%CI 0.01~0.36，P=0.004）、手术/活检+化学治疗+干细胞移植（HR=0.01，95%CI 0.00~0.17，P=0.001）均能改善生存预后，手术/活检+化学治疗+干细胞移植组倾向较其他组预后好（图4，表1）。

图4  26例原发中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的生存曲线

Figure 4  Survival curves of 26 patients with diffuse large B-cell central lymphoma of central nervous system

讨论

中枢神经系统淋巴瘤的临床表现包括局灶性症状和颅内压升高等^［4］，根据发病部位不同其临床表现可有较大差异，而且这些临床表现通常是非特异性的，导致部分患者可能延误诊断。本组患者最常见的临床表现是头痛，其发病到确诊时间从1周到半年，临床需要与脱髓鞘病变、脑梗死、转移癌和胶质瘤等病变鉴别。

该病的影像学表现为大脑深部白质区的单发或多发肿块，肿块周边呈轻、中度水肿，CT上等密度或高密度，T₂WI呈等高信号，T₁WI呈等低信号，弥散加权成像高信号，增强后病灶明显均匀强化。有文献报道PCNSL患者在增强MRI上有85%表现为明显强化，10%的患者表现为中等强化，无明显强化的少见（1%）^［9］。明确诊断依赖于病理活检或脑脊液细胞学^［4］。对于术前考虑到淋巴瘤的诊断或者颅内的多发病变，建议行立体定向活检或术中活检，明确病变性质。术中病理医生应该尽量明确是否为淋巴瘤或胶质瘤，如怀疑淋巴瘤，应尽量避免扩大手术范围，诊断明确后尽早进行化学治疗，可提高淋巴瘤患者生存率。

经文献报道，PCNSL中65%为单发病灶，35%为多发病灶，最常见位置是大脑半球（38.2%），其次是丘脑和基底节（15.9%）、胼胝体（14.1%）^［9］。本组病例中53.3%（24/45）病变为单发病灶，46.7%（21/45）病变为多灶性，大脑半球（68.9%，31/45）是最常见的受累部位，其次是丘脑和基底节（22.2%），结果与文献报道基本一致。由于 PCNSL以血管周围 Virchow-Robin间隙为中心浸润生长，而脑内靠近脑表面及中线区的血管周围间隙较明显，因此肿瘤好发于上述部位^［10］。

淋巴瘤的镜下形态可见肿瘤细胞弥漫分布，瘤细胞围绕血管呈“同心圆状”“袖套状”浸润性生长，部分患者可伴有血管壁浸润和破坏。瘤细胞类似于中心母细胞或免疫母细胞，细胞核大小形态较一致，常呈圆形、卵圆形，免疫组织化学染色可见其表达 CD₂₀、CD₇₉a、Pax5等B细胞标志物，T细胞标志物阴性，B细胞重排检测阳性可帮助鉴别。冰冻诊断较为困难，本组45例患者中有42例送术中冰冻，其中34例（75.5%）术中诊断淋巴瘤或淋巴瘤可能性大，恶性肿瘤7例（其中神经上皮来源可能性大1例，不除外高级别胶质瘤2例，不除外转移癌1例）；炎症性病变1例。因此在术中冰冻病理诊断时需要考虑到与以下病变的鉴别诊断：第一，高级别胶质瘤：临床及影像学常常难以区分，高级别胶质瘤可有栅栏状坏死及血管内皮肾小球状增生，肿瘤与周边脑组织有移行关系；第二，转移癌：需重点观察细胞的形态，转移癌细胞的胞质更丰富，术中印片可以更好鉴别；第三，炎症性病变：常为小淋巴细胞且含有多种炎性细胞背景，术后常规免疫组织化学染色常表现为B、T细胞多克隆性增生。

在开始治疗之前需要对患者进行系统性检查，排查是否系统性淋巴瘤累及中枢、是否有器官移植病史、是否伴有先天性或获得性免疫缺陷综合征等，这些情况可能会影响患者预后或需要改变治疗方案^［11］。中枢神经系统淋巴瘤患者眼部受累约占8%，可能先于中枢神经系统淋巴瘤数月甚至数年^［9］，本组病例中即有1例诊断为眼内淋巴瘤10个月后，脑内出现多发DLBCL。本组45例患者中44例被确诊为PCNSL；1例为系统性淋巴瘤累及中枢，患者曾于2年前诊断为DLBCL。EB病毒感染是免疫功能缺陷患者发生PCNSL的重要致病因素，在人类免疫缺陷病毒感染的 PCNSL 患者中EB病毒的检出率为 80%~100%，而免疫功能正常的患者 EB 病毒检出率仅有4%~16.7%^［12］。本组患者的临床病史及检查结果均未显示有明显的原发或继发的免疫缺陷疾病，其EB病毒的检测结果均为阴性。

我们发现，本组病例中有64.4%（29/45）病例存在MYD88 L265P突变，而且这种突变在非GCB型中的检出率明显高于GCB型，与文献报道基本一致^{［13, 14］}。PCNSL肿瘤恶性程度高，侵袭性生长，病情进展迅速，目前研究发现MYD88基因突变为PCNSL最常见的突变之一^［15］。MYD88基因编码一种信号衔接蛋白，通过刺激TLR、IL1和IL18受体后激活和核因子-κB通路^{［15, 16, 17］}。MYD88 L265P突变位于Toll/IL-1受体（TIR）结构域，通过白细胞介素-1受体相关激酶（interleukin-1 receptor associated kinase，IRAK），可激活核因子-κB信号途径和增强Janus激酶信号转导子和转录激活子3信号，促进细胞增殖^［15］。以往研究表明38%~94%的中枢神经系统原发性DLBCL患者中可检测出MYD88突变^{［2, 3，6，15，18, 19］}，Tang等^［13］发现大约60.4%（32/53）的PCNSL患者存在MYD88 L265P 基因突变。Zheng等^［6］采用Sanger测序发现56.9%（29/51）的PCNSL患者存在MYD88 L265P 基因突变。Gonzalez-Aguilar等^［15］发现38%的PCNSL患者存在MYD88基因突变，且均为相同的L265P突变。Ngo等^［7］发现29%的系统性DLBCL患者存在MYD88 L265P基因突变，而且只发生在ABC型中。不同研究中的MYD88基因突变频率范围可能是由其所用检测方法的不同，以及是仅检测L265P突变，还是同时研究了第3~5外显子中的其他MYD88突变所致^［6］。目前检测MYD88 L265P基因突变的方法包括直接DNA测序、数字聚合酶链反应、高分辨率熔融分析、等位基因特异性聚合酶链反应及焦磷酸测序等^{［20, 21］}。焦磷酸测序技术是一种酶联级联测序技术，适于对已知短序列的测序分析，其可重复性和精确性能和Sanger测序法相媲美，因此，焦磷酸测序提供了一种快速、可靠、高敏感度和经济的方法来检测MYD88 L265P基因突变。

本研究结果显示，是否存在MYD88 L265P基因突变与原发性中枢神经系统DLBCL患者的生存差异相关性不明显。有文献报道MYD88 L265P基因突变与预后较差相关^{［13，22］}，也有文献报道MYD88 L265P野生型和突变型两组PCNSL患者的预后无明显差异^{［14，23］}。虽然MYD88可能不是预后预测因子，但可以作为一种诊断标志物，因为在胶质母细胞瘤中并未发现该突变^［23］。疑似淋巴瘤的患者可以行脑脊液细胞学检测是否存在该突变，可有助于早期诊断和早期治疗。

Fukumura 等^［3］发现MYD88基因突变阳性的肿瘤患者外周血单核细胞中也存在相同的低频率突变，提示MYD88基因突变阳性的肿瘤前体细胞可能起源于中枢神经系统之外，这些细胞进入中枢神经系统，在经过遗传学改变后发展为淋巴瘤，MYD88基因的激活可能是中枢神经系统淋巴瘤的初始和重要遗传改变之一。存在MYD88 L265P基因突变的PCNSL患者可能受益于抑制MYD88信号通路的治疗^［15］。MYD88基因突变还可通过激活IRAK4诱导肿瘤细胞分泌IL-6和IL-10，从而改变细胞因子环境^［6］。研究表明IRAK4抑制剂对伴有MYD88 L265P突变的ABC型的DLBCL有选择性细胞毒性作用，因此可作为治疗伴有MYD88 L265P突变的DLBCL患者的潜在靶点^［24］。对MYD88基因突变和信号传导的研究有望帮助新药研究及推行临床试验，以改善PCNSL，特别是复发难治PCNSL患者的预后。

大部分的中枢神经系统原发性DLBCL均为非生发中心起源^{［25, 26］}，Radotra等^［27］发现80.2%的PCNSL是非GCB型，本组病例以非GCB型为主，与文献报道基本一致。非GCB型DLBCL约占所有系统性DLBCL的40%，在临床上具有更强的侵袭性，其5年无进展生存期率为34%，而GCB-DLBCL的5年无进展生存期率为76%^［2］。

本研究还发现，化学治疗组的预后明显好于未化学治疗组，肿瘤切除+化学治疗组和活检+化学治疗组预后差别不大。目前 PCNSL 患者推荐立体定向活检进行组织病理学诊断，不推荐手术切除。PCNSL 对放射治疗及化学治疗敏感，手术切除创伤较大且可能导致新的神经功能障碍，对预后无明显帮助。手术切除/活检+化学治疗+自体干细胞移植组的预后要明显好于其他组，因此PCNSL 患者经化学治疗后达到完全缓解，再行自体造血干细胞移植治疗，有机会获得长期生存。

自从采用HD-MTX为主的综合化学治疗作为标准治疗形式以来，PCNSL患者的预后有所改善；但是大多数患者均会复发，与其他结外淋巴瘤相比，PCNSL的预后仍然很差，5年生存率仅为22%~40%^［2］。在PCNSL患者中，7%~8%的病例会在疾病的晚期发生全身播散，全身播散最容易累及腹部和腹膜后的淋巴结以及内脏器官。

综上所述，MYD88 L265P是原发性中枢神经系统DLBCL较为常见、特异的基因突变，在淋巴瘤的诊断和治疗中具有重要意义。MYD88基因突变的检测及其相关的基因组研究，可以更好地对患者进行分层，对精确治疗提供有价值的信息。

参考文献略